基因和细胞治疗（Gene and Cell Therapy, GCT）是全球生物技术中最具竞争力的新兴领域之一。作为治疗恶性肿瘤和其他人类疾病的新策略，GCT自20世纪末以来在世界范围内的科研实验和临床试验中均得到了广泛的研究，一系列具有重大影响力的发现也相继问世。
从 RNA 干扰到 CRISPR，本文盘点了过去 20 年获得诺贝尔奖认可的最前沿和最令人惊叹的五项 GCT 相关发现。（文末有福利~）
RNA干扰，致病基因表达的“终结者”我们大多数人都不会对以下论断感到陌生：DNA是遗传信息的载体。
通过转录，DNA可以编码为mRNA。
mRNA可以充当翻译过程中的模板，生成蛋白质。
这整个遗传信息的转录和翻译的过程可以用分子生物学的一个专业名词来概括，即中心法则。在20世纪90年代末，中心法则早已为人熟知，但我们并不完全理解为什么一些人为引入的基因无法在生物体内表达。直到1998年，我们发现了RNA干扰（RNA interference，RNAi），这个困惑才得到了解答[1]。RNA干扰是通过双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)、Dicer蛋白和RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）来阻断遗传信息传递，从而调控基因表达的一种方法。dsRNA进入细胞后，会被细胞质中的 Dicer蛋白切割成小片段，随后在 RISC 中成为单链 RNA (ssRNA)，在那里ssRNA与相应的传递遗传信息的mRNA配对，阻断了蛋白质的合成过程。RNA干扰的主要机制如下图所示： RNA干扰的机制 [2]图片来源：Annika Röhl自从RNA干扰被发现后，该方法迅速被用于激活诱导“沉默”特定的致病基因，并已成功应用于肿瘤、病毒感染、遗传和神经系统疾病等重大领域的疾病治疗。时至今日，RNA干扰的应用场景仍在不断增加。例如，研究人员已经证实，RNA干扰可以通过 “沉默” 必需的病毒基因的表达来抑制病毒感染，并且可以在当前的全球新冠疫情防治方面发挥关键的药物治疗作用 [3]。2006 年，卡罗林斯卡学院的诺贝尔奖大会将诺贝尔生理学或医学奖授予了美国生物学家 Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello，以表彰他们对RNA干扰的发现。基因敲除小鼠，人类实验的完美替身要抑制特定基因的表达，除了利用RNA干扰之外，我们也可以利用基因打靶技术直接将靶向基因敲除。1989 年，研究人员将同源重组技术和胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ES Cells）培养相结合，首次成功敲除了一批小鼠中的特定基因（如 HPRT 或 β-2 微球蛋白基因）[3,4]。此后，小鼠胚胎干细胞中的基因打靶技术成为了改造小鼠基因的经典手段。基因靶向小鼠的产生原理 [6]图片来源：Annika Röhl研究者可以将经过修饰的DNA分子注射进胚胎干细胞，随后再将其植入小鼠体内，诞下基因嵌合小鼠。基因嵌合小鼠与普通小鼠交配，其后代中就会产生基因靶向小鼠。基因打靶为哺乳动物和人类疾病研究提供了无限可能。我们都知道，无论是药品，疫苗还是手术方法，大多数医药研发临床试验前都需要进行动物实验。而小鼠作为与人类高度同源的哺乳动物，往往身先士卒，成为各种疾病模型中人类的替身。基因打靶技术的发现使修饰哺乳动物特定基因并培育携带和表达修饰基因的后代成为可能。这种方法可以向我们揭示特定基因的作用，帮助我们建立小鼠模型并评估基因治疗的效果。由于基因打靶技术在医学中具有深远和革命性的意义，所以这项技术的发现者，Mario R. Capecchi, Martin J. Evans 和 Oliver Smithies，共同获得了2007年的诺贝尔生理学或医学奖。“返老还童”，诱导性多功能干细胞的诞生2012年，在基于胚胎干细胞的基因打靶技术获得诺奖5年后，诺贝尔生理学或医学奖再一次颁发给了干细胞技术的研究者们。干细胞是负责补充和改变机体的特殊细胞。它们可以通过精确复制自己来进行自我更新，也可以在某些情况下，分化成不同的专门细胞来制造大脑、骨骼、血液、肌肉和我们身体的其他重要部分。长久以来，学界普遍认为干细胞的分化过程是不可逆转的。然而，在1962年，英国发育生物学家John Gurdon的一个惊人发现彻底改变了我们对细胞发育的理解。在一项经典的细胞核移植实验中，他用成熟的卵细胞核替换未成熟青蛙卵细胞的细胞核，发现改造后的卵细胞仍然能够发育成正常的可以游动的蝌蚪。这表明成熟细胞的DNA仍然保持着青蛙发育所需的全部遗传信息 [8]。44 年后，日本的干细胞学者Shinya Yamanaka 更进一步，找到了一种将成熟细胞重新 “逆分化” 为多功能干细胞的方法。他将4个基因转移到皮肤细胞中，制造出了能像正常的自然干细胞一样分化成任何一种成年小鼠细胞的 “诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem cell, iPS cell）”[9]。iPS细胞可以分化成各种人类细胞 iPS细胞的发现使人们对人类疾病的细胞基础有了全新的认识。理论上， iPS细胞可以分化成任何类型的人类细胞，这些细胞拥有广阔的应用前景，可以被用于器官合成，组织修复和疾病治疗等领域。 拒绝“刹车”，免疫检查点抑制剂抗癌疗法 T细胞是人体免疫系统产生的一种免疫细胞。当T细胞上的受体识别到肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体上非共价结合的肽蛋白时，T细胞就会活化并攻击肿瘤细胞。然而其他蛋白质也可以通过充当 “加速器” 或“制动器” 来影响 T 细胞的激活过程，其中最著名的影响T细胞激活的负调节因子就是CTLA-4和PD-1。1992年，日本免疫学家Tasuku Honjo领导的一个研究小组报告称，他们在T细胞表面发现了一种特殊的检查点蛋白质，名为程序性细胞死亡蛋白1，也就是鼎鼎有名的PD-1 [10]. 四年后，在另一项里程碑式的研究中，美国免疫学家 James Allison发现，通过在体内注射阻断CTLA-4的抗体，可以增强抗肿瘤免疫 [11]。PD-1和CTLA-4都可以用于调节T细胞，增强机体的抗癌能力，但其对T细胞调节的机制有所不同。 PD-1 和 CTLA-4 检查点抑制抗癌的机制 [12]图片来源：Annika Röhl通过引入抗体来抑制 CTLA-4 或 PD-1对T细胞的 “刹车” 作用，T 细胞就不会再被癌细胞欺骗。这意味着T细胞现在可以不受干扰地自由攻击T 细胞。这一治疗策略对乳腺癌、肺癌、肾癌、脑癌以及侵袭性皮肤癌等常见癌症非常有效。2011 年，全球首款靶向 CTLA-4 的检查点抑制剂ipilimumab获批上市，用于治疗晚期黑色素瘤。六年后，PD-1 抑制剂也被批准用于人类癌症治疗。T 细胞 “刹车” 及免疫检查点抑制剂的发现为基因和细胞治疗带来了一个全新的研究领域。由于影响深远，这一领域的先驱者们获得了2018年的诺贝尔生理学或医学奖 [12]。CRISPR-Cas9，划时代的 “基因魔剪” 在过去的十年里，人类在基因组精确编辑方面取得了巨大的飞跃，这在很大程度上要归功于CRISPR的发现。CRISPR的发现史可以追溯到上世纪80年代，当时日本分子生物学家Yoshizumi Ishino意外地在大肠杆菌中发现了一个不寻常的DNA序列 [13]。他是最早在原核生物中观察到 CRISPR 的研究人员之一。六年后，西班牙微生物学家Francisco Mojica 终于描述了完整的规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）序列，他也创造了“CRISPR”一词，并提出 CRISPR 是细菌的先天免疫系统 [14]。然而，直到十年前，科学家们才正式把CRISPR开发成了一种工具。2011 年，法国微生物学家 Emmanuelle Charpentier 在 Nature 上发表了一篇论文，描述了一种名为 Cas9 的细菌酶切割入侵病原体的过程 [15]。随后，她与美国生物化学家 Jennifer Doudna一起，将Cas9与合成的单向导 RNA（single guide RNA, sgRNA）结合，成功切割了目标细菌的 DNA 序列 [16]。这一革命性的突破催生了CRISPR-Cas基因编辑系统，这把神奇的 “基因魔剪” 可以被广泛使用。只需要通过简单地重新设计和合成sgRNA，科学家就可以精确地切断几乎任何有机体的特定DNA序列。自2012年问世以来，CRISPR-Cas9基因编辑技术迅速席卷了世界各地大量研究遗传疾病和癌症治疗的实验室。作为整个科学史上最具开创性和变革性的发现之一，许多学者从一开始就预测CRISPR基因编辑技术将会获得诺贝尔奖。不出所料，这一预测在去年成为了现实。CRISPR的突破性发现为 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna 赢得了2020年的诺贝尔化学奖。不过，不少学者认为CRISPR的巅峰还远未到来。随着CRISPR技术在疾病治疗领域的不断拓展，这一发现获得诺贝尔生理学或医学奖或许也只是时间上的问题。
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参考文献（上下滑动查看完整）：[1] Fire, Andrew, et al. "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans." nature 391.6669 (1998): 806-811.[2] Press release. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach AB 2021. Sun. 5 Sep 2021.